Expérimentataion et instrumentation biologique

Céline-Hivda Yegen, Mélissa Bourenane, Chaymae Boucheniata, Richard Souktani, Sophie Lanone.

Université Paris-Est Créteil UPEC, INSERM IMRB U955 GEIC2O.

Correspondance : celine-hivda.yegen@inserm.fr

RESUME

Notre équipe s’intéresse à l’impact des éléments de l’exposome dans différentes pathologies pulmonaires (https://imrb.inserm.fr/equipes/s-lanone/). Dans ces projets, nous nous intéressons particulièrement à l’impact des différents éléments environnementaux sur l’évolution de la fonction pulmonaire dans différents modèles murins de pathologie pulmonaire. L’analyse de la fonction pulmonaire in vivo est rendue possible grâce à de nombreux outils présents sur le marché.  Les analyses fines des variables ventilatoires résultent d’une intubation orotrachéale de l’animal nécessitant une anesthésie profonde de celui-ci. Cette composante technique limite le recueille de ces informations uniquement en phase terminale, de ce fait, un suivi longitudinal des variables ventilatoires n’est pas réalisé dans de nombreux travaux.

Une étude montre que l’intubation orotrachéale donne des résultats très semblables à ceux obtenus par intubation intra-trachéale (Bonnardel, E et al., 2019). De ce fait, les mesures longitudinales de la fonction pulmonaire pourraient-être réalisé par intubation orotrachéale (Bonnardel, E et al., 2019).

Dans ce cadre, nous avons détaillé un protocole technique nous permettant de réaliser des mesures longitudinales de la fonction pulmonaire par intubation orotrachéale avec le Flexivent®.

MOTS CLES

Souris, Flexivent®, Mesures répétées, Mécanique ventilatoire, Intubation orotrachéale.

INTRODUCTION

La caractérisation fine des propriétés ventilatoires des poumons chez les petits animaux est essentielle depuis l’essor des modèles murins en science respiratoire.

Ces mesures des paramètres ventilatoires, lorsqu’elles sont basées sur une technique d’oscillation forcée (FOT), donnent des informations puissantes pour caractériser de manière précise la mécanique ventilatoire (McGovern, T. K., 2013, Kopf, K. W.,2020, Ahookhosh, K., 2023). Cette technique consiste à analyser des signaux de pression et de volume acquis sous forme d’onde de flux d’air oscillatoire prédéfinie de faible amplitude appliquée à l’ouverture des voies respiratoires du sujet.

Parmi les différents outils disponibles sur le marché, le Flexivent® est le premier instrument de mesure de la mécanique ventilatoire à utiliser la technique du FOT chez l’animal et notamment les models murins. La FOT à fréquence unique permet de mesurer la résistance (Rrs), l’Elastance (Ers) et la compliance (Crs) du système respiratoire (McGovern, T. K., 2013, Kopf, K. W.,2020, Ahookhosh, K., 2023). De plus, ce système permet également de générer des manœuvres expiratoires forcées afin de mesurer

la FEV0.1 (volume expiratoire forcé dans les premières 0.1s), la CVF (capacité vitale forcée), et en déduire le rapport FEV0.1/CVF.  Ceci est réalisé par la connexion des voies respiratoires de l’animal à une colonne à pression négative tout en gonflant les poumons de la souris jusqu’à atteindre une pression donnée (Shalaby, K. H., et al 2010, Ahookhosh, K., 2023).

Le Flexivent® est utilisé dans de nombreux travaux afin d’évaluer et d’élucider de manière précise l’évolution de la fonction pulmonaire. Ces mesures réalisées par cet instrument nécessitent une intubation orotrachéale, et de ce fait une anesthésie profonde suivie d’une étape de trachéotomie de l’animal. De ce fait, le suivi de l’évolution de la mécanique ventilatoire par des mesures répétées dans le temps reste limitée.

Dans ces travaux, nous avons réalisé sur une même souris deux mesures répétées de la fonction pulmonaire par une intubation oropharyngée espacée de deux semaines.

MATERIEL ET REACTIFS

Flexivent® (https://www.scireq.com/flexivent/)

Sonde d’intubation souris (HUGO SACHS ELETRONIK, OD 1.2mm, L 30mm).

Tapis chauffant.

Respirateur.

1 aiguille de 26G.

Planche inclinée d’instillation.

NaCL® 0.9% injectable.

Microscope de chirurgie.

Lampe froide.

2 micro-pinces plates incurvées à extrémités émoussées de chirurgie.

Kétamine® 80mg/kg.

Xylazine® 10mg/kg.

PROCEDURE

-Peser l’animal.

-Injecter par voie intrapéritonéale le volume du mélange d’anesthésique de kétamine à 80mg/kg et de Xylazine à 10mg/kg nécessaire en fonction du poids de la souris (10µl/g).

-Vérifiez le niveau d’anesthésie à l’aide d’un stimulus de pincement de patte quelques minutes après l’administration de l’anesthésique.

NB : Les mesures répétées nécessitent un réveil de l’animal, de ce fait, aucune étape de curarisation n’est envisageable dans ce protocole. Pour ce faire, nous utilisons un mélange de Kétamine (80mg/kg) et de Xylazine (10mg/kg) afin de conduire à un sommeil profond de l’animal et un relâchement des muscles respiratoires.

-Suspendre la souris à la planche par ses incisives.

-À l’aide d’une pince, saisir soigneusement la langue de la souris et la positionnez jusqu’à visualiser les cordes vocales (Fig 1.a).

-Intuber par voie orotrachéale l’animal à l’aide de la sonde et vérifier qu’elle est bien placée (Fig 1.b).

NB : La sonde d’intubation décrite dans la partie « Matériel et Réactifs » est adapté pour des souris ayant un poids corporel compris de 20 à 35g.

-Connecter rapidement l’animal au Flexivent® et réaliser les mesures des variables ventilatoires.

-Débrancher la souris du Flexivent®.

NB : Bien vérifier que toutes les perturbations réalisées au Flexivent sont acceptées. Le cas échéant, vérifier que la sonde épouse bien toute la paroi interne de la trachée et que l’animal est bien anesthésié.

-Placer la souris en décubitus dorsal sur le tapis chauffant et la brancher au respirateur Minivent® (débit de 150µl/min ; volume courant de 100µl) (Vidéo en annexe).

-Surveiller la souris connectée au respirateur et la stimuler par pincement des pattes.

-Débrancher la souris du respirateur lorsqu’elle réagit à un stimulus.

-Retirer doucement la sonde d’intubation lorsque des mouvements des vibrisses sont observés.

-Placer la souris sur le flanc gauche dans une chambre de réveil à 27°C et 100% de dioxygène (O2).

-Une fois la souris réveillée, la replacez dans une cage avec des croquettes humides placées au fond de la cage.

RESULTATS

Figure 1 1

Figure 1 : Mise en évidence des cordes vocales et intubation orotrachéale. Mise en évidence des cordes vocales à l’aide de micro-pinces plates (a.). Intubation orotrachéale (b.).

Le suivi du poids corporel de nos souris ne montre aucune différence entre les souris ayant été soumises au Flexivent® comparé aux souris non soumises au Flexivent® (Fig2).

Figure 2 1

Figure 2 : Suivi du poids corporel des souris. Le suivi du poids corporel pour le groupe de souris non soumis au Flexivent® (Courbe grise, n=4) et soumis au Flexivent® (Courbe bleue) a été réalisé tout au long de la procédure expérimentale. Le poids de l’ensemble des souris de ce projet a été mesuré une semaine avant le début de l’expérimentation (point à l’origine). Le poids des souris soumises au Flexivent® a été évalué avant la première mesure (1ère mesure) et avant la seconde mesure (2nd mesure). La prise de poids (en gramme, g) a été déterminé par la différence du poids mesuré à un temps donné et le poids mesuré avant la première semaine de l’expérimentation. Un test de Friedman suivi d’un test de comparaisons multiples de Dunn a été réalisé pour estimer la différence de poids des souris par rapport au poids initial.

L’analyse de la fonction pulmonaire nous montre aucunes différences significatives pour les différents paramètres ventilatoires suivants : la Rrs (Fig.3a), la Crs (Fig.3b), la FEV0.1S(Fig.3c), la FVC (Fig.3.d) et le rapport FEV0.1S/FVC entre les souris ayant été connectées deux fois au Flexivent® comparées à celles dont la fonction pulmonaire n’a été mesurée qu’une seule fois (Fig3).

Figure 3 1

Figure 3 : Mesure de la fonction pulmonaire. Représentation de la résistance du système respiratoire (Rrs en cmH2O.s/ml), la compliance du système respiratoire (ml/cmH2O), du volume expiré forcé à 0.1 seconde (Forced Expiratory Volume en anglais, FEV 0.1s en ml), la capacité vitale forcé (Forced Vital Capacity en anglais, FVC en ml) ainsi que le ratio FEV0.1s/FVC obtenus suite à la première (1ère mesure, n=6) et seconde (2nd mesure, n=6) mesure par le Flexivent® sur souris anesthésiées et intubées. Toutes les valeurs sont représentées en moyenne ± SD, des test Mann Whitney ont été réalisé.

L’analyse de la morphologie pulmonaire par coloration à l’Hématoxyline-Eosine ne montre pas de différence entre les souris passées au Flexivent® (Fig 4b et c.) comparées aux souris sans Flexivent (Fig4.a). Aucune modification des dépôts de collagène de la matrice-extracellulaire n’est observée par coloration au Rouge Sirius (Fig 4) chez les souris dont la fonction pulmonaire a été évalué par Flexivent® (Fig 4.e et f) comparé aux souris sans Flexivent® (Fig4.d).

Figure 4

Figure 4 : Cartographies des biopsies pulmonaires des lobes gauches des souris. Représentation des cartographies du lobe pulmonaire gauche colorées à l’Hématoxyline-Eosine (a., b., c.) et au Rouge Sirius-Fast Green (d., e., f.) des souris non soumises au Flexivent® (n=4), souris prélevées suite à la 1ere mesure au Flexivent® (n=6), souris prélevées suite à la 2nd mesure au Flexivent®(n=6).

REMERCIEMENTS

Ce travail a été supporté par l’équipe GEIC2O de l’INSERM IMRB U955.

Ce travail a été financé en partie par l’UPEC – Pré-maturation 2023.

Nous remercions toute l’équipe de la zootechnie de l’EP3 pour leur gestion et prise en charge de nos animaux.

Nous remercions l’UPEC pour son soutien à l’édition de ce premier numéro de Tr@nsmettreRIF.

CONFLITS D’INTERET

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

ETHIQUE

Ce projet a été autorisé par le ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche numéro d’agrément A94028379 – APAFIS#27046-2020090317505897 5v.

NOMENCLATURE

FEV0.1S : Volume expiratoire forcé dans les premières 0.1s

Crs : Compliance du système respiratoire

FVC : Capacité vitale forcée

Ers : Elastance du système respiratoire

O2 : Dioxygène

Rrs : Résistance du système respiratoire

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE

Ahookhosh, K., Vanoirbeek, J., & Vande Velde, G. (2023). Lung function measurements in preclinical research: What has been done and where is it headed? Frontiers in physiology, 14, 1130096. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1130096.

Bonnardel, E., Prevel, R., Campagnac, M., Dubreuil, M., Marthan, R., Berger, P., & Dupin, I. (2019). Determination of reliable lung function parameters in intubated mice. Respiratory research, 20(1), 211. https://doi.org/10.1186/s12931-019-1177-9.

Kopf, K. W., Harral, J. W., Staker, E. A., Summers, M. E., Petrache, I., Kheyfets, V., Irwin, D. C., & Majka, S. M. (2020). Optimization of combined measures of airway physiology and cardiovascular hemodynamics in mice. Pulmonary circulation, 10(1), 2045894020912937. 

McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., & Martin, J. G. (2013). Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of visualized experiments: JoVE, (75), e50172. https://doi.org/10.3791/50172.

Shalaby, K. H., Gold, L. G., Schuessler, T. F., Martin, J. G., & Robichaud, A. (2010). Combined forced oscillation and forced expiration measurements in mice for the assessment of airway hyperresponsiveness. Respiratory research, 11(1), 82. https://doi.org/10.1186/1465-9921-11-8.

  • Mesures longitudinales des variables ventilatoires d’une souris par Flexivent®.

    Mesures longitudinales des variables ventilatoires d’une souris par Flexivent®.
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    Date de publication : 20/11/2023
    Voir publication

  • Protocole d’exploration fonctionnelle respiratoire sur souris juvénile

    Protocole d’exploration fonctionnelle respiratoire sur souris juvénile
    Chez l’Homme, l’exploration fonctionnelle respiratoire (EFR) regroupe un ensemble d’examens consistant à déterminer la capacité respiratoire d’un individu contribuant au diagnostic et au suivi de pathologies pulmonaires telles que l’asthme (1), le syndrome de détresse respiratoire aiguë (2) ou encore la Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) (3)... Pour réaliser ces examens, les outils les plus communément usités sont le pléthysmographe utilisé pour évaluer les volumes respiratoires ou le spiromètre permettant d’étudier des débits ventilatoires comme le Volume Expiratoire Maximal par Seconde (VEMS), la Capacité Vitale Forcée (CVF)… La spirométrie nécessite la participation active du patient produisant une inspiration et une expiration forcées. Dans le cadre de l’expérimentation animale, il n’est pas possible d’obtenir cette participation. Des appareils ont ainsi été développés afin d’effectuer des examens comparables chez l’animal. C’est le cas du FlexiVent® qui permet de mesurer des débits ventilatoires simulés et des paramètres de mécanique respiratoire (Capacité Inspiratoire, Compliance, Elastance…). L’évaluation de ces paramètres chez la souris juvénile n’a jusqu’alors pas été possible. Toutefois, dans le cadre des études d’atteintes précoces, ces informations sont d’une importance capitale, en nous renseignant notamment sur l’état de maturation pulmonaire. Nous proposons ici un protocole d’exploration fonctionnelle respiratoire permettant la mesure de tels paramètres chez la souris juvénile à l’aide du FlexiVent®. Nous montrons ensuite que l’évaluation morphométrique est impactée par cette technique et doit donc être évaluée sur un autre lot d’animaux.
    Date de publication : 20/11/2023
    Voir publication

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    Evaluation longitudinale de l’activité du canal CFTR : modèle de sécrétion salivaire chez la souris
    La mucoviscidose est une maladie génétique due à une mutation du gène CFTR. Cette mutation entraîne l’absence de la protéine CFTR ou la production d’une protéine présentant des anomalies fonctionnelles. Ces anomalies affectent le transport d’électrolytes (ions Cl- et Na+) et d’eau au niveau des épithéliums, incluant ceux des glandes sudoripares et des glandes salivaires. Chez l’Homme, la fonction de CFTR est évaluée en première instance par le test de la sueur dont l’équivalent murin est le test de sécrétion salivaire. Chez l’Homme, ce test est réalisé dans un but de diagnostic initial de la maladie mais également à des fins de suivi de l’efficacité thérapeutique de modulateurs de CFTR. Chez la souris, le test de sécrétion salivaire n’a, à notre connaissance, jamais été réalisé à des fins de suivi évolutif de la fonction de CFTR. Ainsi, nous avons mis au point une version longitudinale du test de sécrétion salivaire permettant d’évaluer une éventuelle modification de la fonction de CFTR au cours du temps. Nous nous intéressons, dans l’équipe, aux effets d’agressions environnementales sur le phénotype de la mucoviscidose et nous avons choisi d’évaluer l’impact d’une exposition à la pollution atmosphérique sur l’activité de CFTR. Par la réalisation de ce test, nous avons ainsi pu mettre en évidence une modification partielle de l’activité de la protéine CFTR après exposition à la pollution atmosphérique. Cette modification suggèrerait une augmentation de l’activité de la protéine CFTR à la suite d’une telle exposition. Par ailleurs, il apparaît que le sexe semble être une variable importante dans la modulation de l’activité fonctionnelle du canal CFTR.
    Date de publication : 20/11/2023
    Voir publication

  • Pneumonectomie du lobe pulmonaire gauche chez la souris -Modèle de croissance pulmonaire in vivo

    Pneumonectomie du lobe pulmonaire gauche chez la souris -Modèle de croissance pulmonaire in vivo
    Au laboratoire, nous étudions l’effet des agressions atmosphériques sur le poumon du nouveau-né et de l’adulte. Nous avons démontré que les lipo-fibroblastes peuvent induire une régénération des tissus lésés dans le poumon. En effet, la délétion d’un inhibiteur du cycle cellulaire le p16INK4 est associée à une augmentation du nombre des lipo-fibroblastes capables de se différencier en pneumocytes et par voie de conséquence elle induit la formation de nouveaux alvéoles après une lésion pulmonaire (1). Dans ce cadre, nous avons développé un modèle préclinique d’ablation du lobe pulmonaire gauche (Pneumo-Nectomie Gauche : PNG) chez la souris avec un taux de réussite supérieur à 90%. Afin que ce modèle de PNG chez la souris soit facilement reproductible par d’autres chercheurs, nous avons décidé de rédiger cette procédure avec un maximum de détails et de supports. Il est recommandé que seules des personnes initiées à la microchirurgie thoracique suivie du réveil de la souris réalisent ce protocole.
    Date de publication : 20/11/2023
    Voir publication